Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer
Protocol (English)
- PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）を用いて、特定のDNA断片だけを選択的に増幅させることができます
- 鋳型DNA
- PCRマスターミックス（DNAポリメラーゼ、バッファー、dNTP含む）
- プライマー（フォワードとリバースのセット）
- ヌクレアーゼフリー水、精製水
- 0.2ml PCRチューブ
- アイスボックス
- マイクロフュージ
- マイクロピペット・ピペットチップ（1-10μl）
- サーマルサイクラー（Bento Labなど）
| ステップ | 温度 | 時間 |
|---|---|---|
| 1. 最初の熱変性 | 98°C | 30秒 |
| 2. 熱変性 | 98°C | 10秒 |
| 3. アニーリング | 45-72°C | 30秒 |
| 4. 伸長 | 72°C | 30秒 |
| 5. 最後の伸長 | 72°C | 300秒（5分） |
| 6. ホールド | 15°C | - |
※2-4のステップを25-35サイクル繰り返す
アニーリング温度の計算には「NEB Tm Calculator」などを使用します
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PCRに必要な試薬類は、使用前に冷凍庫から取り出して、氷上に立てておきます
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特に、PCRマスターミックスやプライマーは凍結していますので、室温で溶かし、よく混合してから氷上に立てておきます
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すべての試薬類は使用前にマイクロフュージで軽くスピンダウンしておきます
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0.2ml PCRチューブの中に、以下の試薬を順に入れていき、緩やかなピペッティング、または軽くタッピングして混合します
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チューブ内に溶液が飛散している場合は、マイクロフュージでスピンダウンします
| 試薬 | 分量 |
|---|---|
| 2X PCRマスターミックス | 10 μl |
| 精製水 | 7 μl |
| 10μM フォワードプライマー | 1 μl |
| 10μM リバースプライマー | 1 μl |
| 鋳型DNA | 1 μl |
| 計 | 20 μl |
- サーマルサイクラーに、反応液を調製した0.2ml PCRチューブをセットして、PCRを開始します